Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama). / Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama).

OBJECTIVES: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. MATERIALS AND METHODS: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. RESULTS: The venom's LD50 was 3.96 µg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 µL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. CONCLUSIONS: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

OBJETIVOS: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. MATERIALES Y MÉTODOS: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. RESULTADOS: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. CONCLUSIONES: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama) / Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama)

RESUMEN Objetivos: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. Materiales y métodos: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. Resultados: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. Conclusiones: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

ABSTRACT Objectives: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. Materials and methods: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. Results: The venom's LD50 was 3.96 μg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 μL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. Conclusions: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

Caracterización biológica y acción de inhibidores de una fosfolipasa A2 del veneno de Lachesis muta / Biological characterization and inhibitors action of Phospholipase A2 from Lachesis muta venom

El presente trabajo informa de la purificación y caracterización bioquímica y biológica de la fosfolipasa A2 (PLA2) de Lachesis muta (Linnaeus, 1766). La purificación se realizó por cromatografía liquida (CL) usando CM-Sephadex C-50 y Sephadex G-50, obteniéndola al estado homogéneo con un peso molecular de 18749 Da. Los ensayos con PLA2 realizados sobre fosfolípidos de yema de huevo y lecitina comercial, mostraron que los agentes EDTA, PMSF, glutatión y cisteína, inhibieron la actividad con valores mayores al 50%. La PLA2 de L. muta produjo un notable efecto anticoagulante, observándose un retardo de 2'30' en el tiempo de coagulación con 9,6 microgramos de la enzima. La hemólisis indirecta sobre eritrocitos humanos dio un equivalente de 4,35 microgramos como dosis hemolítica media (HD50). Los valores de dosis edemática media y dosis miotóxica mínima fueron de 91,5 microgramos y 125,89 microgramos/mL respectivamente; valores por debajo de PLA2 de otros venenos. No se registró actividad hemorrágica directa. Las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que PLA2 de L. muta tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú). Sin embargo, la neutralización por el antiveneno fue parcial.

In the present study, phospholipase A2 (PLA2) from Lachesis muta (Linnaeus, 1766), is isolated, purified and characterized biochemically and biologically. Purification was performed by liquid chromatography (LC) using CM-Sephadex C-50 and Sephadex G-50, homogenized enzyme had a molecular weight of 18749 Da. Trials with egg yolk phospholipids, and commercial lecithin showed that EDTA, PMSF, glutathione and cysteine inhibited the activity with values greater than 50%. The PLA2 had a significant anticoagulant effect, showing a delay of 2'30" on the coagulation time with 9.6 microgramos of the enzyme. The indirect impact on human erythrocyte hemolysis gave an equivalent of 4.35 microgramos as HD50. Mean edematic dose and minimum myotoxic dose were 91.5 mg and 125.89 mg / mL respectively, these values were below enzymes phospholipase A2 from others poisons. There was no hemorrhagic activity. Immunodiffusion tests and immunoelectrophoresis revealed that the PLA2 of L. muta was immunogenic reactivity against lachesic monovalent antivenom (INS-Peru). However, the neutralization by the antivenom was partial.

Análisis cromatográfico del contenido enzimático del veneno de tres serpientes peruanas / Chromatography analysis of enzyme content in three Peruvian snake venom

Las serpientes que habitan la selva amazónica tienen venenos cuya composición varía con la especie. Pero existen también especies de coste y otras que son arborícolas cuyo estudio es motivo de interés para este laboratorio. En dos serpientes de costa Bothrops pictus y Bothrops rodengheri así como en una de selva, arborícola, Bothriopsis oligolepis; se ha realizado una exploración de las principales enzimas contenidas en sus venenos luego de efectuar un fraccionamiento cromatográfico. Para ello, muestras de 50 mg. De cada veneno se fraccionaron en una columna de Sephadex G-100 con buffer acetato de amonio 0.05 M, pH 7.0 analizándose luego las actividades enzimáticas de Hialuronidasa, fosfodiesterasa, 5’ nucleotidasa, Similar a Trombina, Proteasa y Fosfolipasa A2. Los resultados mostraron variaciones muy notables en los pisos de proteínas de los venenos utilizados, así como la posición relativa y la actividad de las enzimas en estudio. En el veneno de B. oligolepis se encontraron 3 picos proteicos definidos mientras que las ponzoñas de las serpientes de costa tuvieron perfiles semejantes entre sí. Así mismo las actividades de Fosfodiesterasa, 5’ Nucleotidasa y Hialuronidasa tienen los valores de Ve/ Vo más pequeños, habiéndose encontrado en B. rodengheri esta última actividad, en cambio la Fosfolipasa A2 mostró valores de Ve/Vo notablemente elevados. También se encontraron diferencias en las actividades específicas de las enzimas investigadas pudiéndose deducir a partir de ellas, el rol biológico que cumplirían durante en envenenamiento.

In the Amazonic jungle habit snakes and their venoms have different chemical composition according to species. Besides there are some snakes from coast and others habit on trees having their venoms a particular interest to our laboratory. The venoms of Bothrops pictus and Bothrops rodengheri (both snakes) as well as Bothriopsis oligolepis (tree snake) have been in investigated on enzymatical composition after a chromatographical fractionation. 50 mg of each venom were fractionated on a Sephadex G-100 column, using 0.05 M ammonium acetate pH 7.0 as eluting. Thus, Hyaluronidase, Phosphodisterase, 5’-nucleotidase, Thrombin-like Enzyme, Proteolytic and Phospholipase A2 activities were measured after that. The results showed remarkable variation on peaks of protein obtained, as well as chromatographical position and activity in each case. On B. oligolepis venom three peaks were obtained while protein profile of coast snake venoms were similar. Phosphodiesterase, 5’-nucleotidas and Hyaluronidase exhibited little Ve/Vo values, however Hyaluronidase activity was not registered in B. rodengheri. Phospholipase A showed a great V/V values in all venoms in study. In addition specific activity differences were found among the three venoms, thus a biological effect would be related to these activity values.